科瑞恩特
  • Home
  • 产品新闻
  • AP-SMALDI 3D质谱成像技术可视化呈现药用植物马利筋叶片中防御性代谢物空间分布及变化

AP-SMALDI 3D质谱成像技术可视化呈现药用植物马利筋叶片中防御性代谢物空间分布及变化

        导言:基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)发展至今,受到国际及国内众多专家学者的关注与认可。该技术既能够可视化呈现目标化合物在组织和细胞中的二维离子密度图,还能够同时呈现众多其它化合物的组成、相对丰度及空间分布情况,实现对生物样本的无标记、高通量检测。自动聚焦3D AP-SMALDI质谱成像技术的横空出世为非平面生物样本的检测提供了更为高效和强有力的技术支撑,可直接用于植物叶片、花瓣等样本表面化合物的可视化分析。自然界中,植物在整个生长周期内会受到来自方方面面的威胁,如生物胁迫和非生物胁迫,其中生物胁迫包括植食性动物以及各种病原微生物的侵害。为了面对植食性动物这个宿敌,植物的防御手段也可谓多种多样,其中直接防御措施就是植物在被取食时产生有毒的次生代谢产物以此伤害来侵害的植食性动物,影响其生长发育。

        2021年2月5日,德国吉森大学Bernhard Spengler教授团队在Analytical and Bioanalytical Chemistry上发表了名为 “3D-surface MALDI mass spectrometry imaging for visualising plant defensive cardiac glycosides in Asclepias curassavica ”的文章,研究人员利用3D表面MALDI-MSI技术,以马利筋为研究对象,对马利筋苷等8种强心苷类植物防御性物质进行了空间解析。结果表明,大量防御相关代谢物分布于机械损伤(模拟草食动物攻击) 马利筋叶片(叶片表面高度变化达700μm)的受损伤部位。本研究充分展示了自动聚焦AP-SMALDI质谱成像技术的强大能力和潜在的适用性,能够分析近生理状态下植物样品的三维表面化合物分布信息。

标题4

       在分析受损伤马利筋叶片之前,作者利用3D AP-SMALDI质谱成像技术分析了完整叶片上强心苷类防御物质的空间分布。结果表明,在完整叶片中8种强心苷类防御性代谢物均分布在主脉内,即分布于无节乳汁管细胞所包含的高浓度乳汁中(图1)。

4 1

       图1(a)3D AP-SMALDI MSI检测后的马利筋叶片光学显微图像。(b)叶片表面激光烧蚀斑放大图像。(c)完整马利筋叶片3D光学显微图像,叶片表面高度变化高达350μm(图示蓝色到红色表示叶片表面高度越来越高。d RG叠加的MSI图像,马利筋苷(m/z613.2410,[M+K]+,红色)二糖(m/z381.0793[M+H]+,绿色)。(e)从叶片叶脉区域获得的质量范围为m/z420-620的单像素质谱图。MSI图像178×178pixels,空间分辨率45μm,比例尺a、c、d为1mm、b为150μm。

       随后作者检测了机械损伤1小时后的马利筋叶片,结果显示,强心苷类防御性代谢物均集中分布于受损部位(图2)。由于在叶片受损10min后其伤口处即可检测到高浓度强心苷(图3a-c),故用强心苷合成增多来解释这一现象貌似并不合理。因此,本研究与以往研究一致认为乳汁是一种可分配的防御物质,即叶片受损伤后乳汁在第一时间运输至受伤部位,使得有毒防御化合物在损伤部位迅速富集。

4 2

       图2(a)3D AP-SMALDI MSI检测后的马利筋叶片光学显微图像。(b)马利筋叶片3D光学显微图像,损伤部位的高度差最高可达400μm。(c)RGB叠加MSI图像,乌拉卡定(m/z569.2132,[M+K]+,红色)二糖(m/z365.1056,[M+Na]+,绿色)三羟基黄酮丙二酰糖苷(m/z557.0692,[M+K]+,蓝色)。(d) 乌拉卡定(m/z569.2132,[M+K]+)。(e)二糖(m/z365.1056,[M+Na]+)。(f)三羟基黄酮丙二酰糖苷单离子图像(m/z557.0692,[M+K]+)。MSI图像143×171 pixels,空间分辨率35μm,所有比例尺均为1mm。

       进一步作者考察了防御代谢物不同时间点的积累速率,作者分别检测了伤口间隔时间为4h50min(即叶片受损伤5h和10min后进行检测)和22h(即叶片受损伤24h和2h后进行检测)的机械损伤叶片。结果显示,间隔时间较短的两个伤口处强心苷类物质的积累量相差不大,而间隔时间较长的两个伤口处则呈现出明显的差异。叶片受损24小时后,受损部位强心苷类物质明显减少,表明该类物质随着时间的延长发生了转移或降解(图3)。

4 3

       图3(a,d)AP-SMALDI MSI检测后叶片3D光学显微图像,对受伤区域进行标记,并标出相关的时间间隔。(b,e)3D显微图像,叶片表面高度差分别达500μm和600μm。(c,f)RGB叠加MSI图像calotoxin(m/z587.2250,[M+K]+,红色)二羟基黄酮(m/z255.0652,[M+H]+,绿色)m/z255.2110(蓝色) MSI图像c111×111 pixels,空间分辨率45μm,f112×103 pixels,空间分辨率35μm,比例尺为1mm。

       植物有防御手段,动物亦有捕食策略。许多植食性昆虫通过脉切的方式来阻止植物防御。例如,捕食时昆虫先切断叶脉上端,使防御物质不能再转移并积累在下游部位。因此,作者采用3D AP-SMALDI MSI技术对脉切叶片的近心端(切口上游)及远心端(切口下游)伤口进行检测,发现远心端比近心端防御性代谢物积累明显减少,说明脉切影响像Uscharin这类的防御性物质的转移使其不能到达下游叶片发挥其防御作用,揭示了为什么大多数含有乳汁的植物(如马利筋)的专门捕食者在取食叶片时采用脉切作为一种预防中毒的策略。

4 4

       图4(a)AP-SMALDI MSI检测前叶片表面的光学显微图像,叶片表面渗出乳汁的区域被红线标记出来。(b)叶片3D光学显微图像,高度差高达700μm。(c, d)RGB叠加MSI图像Uscharin(m/z626.2189,[M+K]+,红色),(d)脱镁叶绿素a(m/z909.5291,[M+K]+,红色)m/z771.4869(蓝色)丙二酰染料木甙(m/z557.0692,[M+K]+,绿色)是目标化合物c、d的背景信号。MSI图像157×171pixels,空间分辨率40μm,比例尺为1mm。

       结论:本文采用自动聚焦3D AP-SMALDI MSI技术对马利筋叶片中防御性代谢物进行了精确定位,表明乳汁是植物抵御组织损伤和潜在植食性昆虫攻击的化学防御机制的一部分,植物叶片受损后,乳汁流向伤口的速度增加,使得防御物质在叶片受损部位积累, 并进一步分析了这种积累速率在时间和空间上的变化。此外,研究人员模仿昆虫的捕食策略(脉切)来抵御这种防御机制,观察到在切割伤口的远端有较少的有毒代谢物积累。同时,大量未识别的离子信号显示出与强心苷类物质具有相同的空间分布,表明马利筋中存在着多种多样的防御性物质。因此,在MALDI 质谱成像的背景下,以HPLC-MS作为补充方法的非靶向代谢组学是发现和研究植物与草食性昆虫和病原菌相互作用关系的绝佳方法,与此同时,组织原位MALDI MS/MS检测同样有助于对未知代谢物的鉴定。